Como se faz uma análise de canabinoides?

Já alguma vez se perguntaram como se determinam os níveis de CBD, THC e outros canabinoides na canábis ou nos óleos de CBD? Neste artigo vamos explicar a ciência por detrás dos métodos que permitem quantificar os canabinoides, como a cromatografia gasosa, a HPLC e a espetrometria de massa, e como estas técnicas são utilizadas em conjunto para analisar os componentes da canábis.

Introdução à análise de canabinoides

A análise de canabinoides é utilizada com vários fins, tanto terapêuticos como regulamentares. O seu principal objetivo é determinar a potência e a qualidade dos produtos de canábis, mas também pode ser utilizada para classificar legalmente uma amostra como «cânhamo» ou «marijuana», com base no seu teor de THC. Constitui, assim, uma ferramenta muito útil tanto para os consumidores como para os profissionais da indústria da canábis.

O que são os canabinoides e como são produzidos na planta?

Os canabinoides são um tipo de compostos químicos que se encontram predominantemente na planta de Cannabis sativa. Estes formam-se nos tricomas, umas estruturas glandulares muito pequenas que se encontram sobretudo nas inflorescências das plantas fêmea de canábis, mais conhecidas como flores de canábis.

Uma particularidade dos canabinoides é que são produzidos pela planta na sua forma ácida, expressa com um «A» no fim da sigla. É por isso que alguns dos compostos ácidos mais conhecidos são o ácido Δ-9-tetra-hidrocanabinólico (THCA) e o ácido canabidiólico (CBDA).

Quando os canabinoides são aquecidos, passam às formas neutras, os canabinoides que todos conhecemos ou os mais populares, como o tetra-hidrocanabinol (THC) e o canabidiol (CBD). Isto acontece com o aquecimento, ao perderem dióxido de carbono (CO2), num processo chamado descarboxilação.

Estas formas ácidas e neutras dos canabinoides podem ser medidas de diferentes maneiras e, neste texto, vou explicar-vos algumas.

Compreender a cromatografia: uma ferramenta-chave na análise de canabinoides

O que é a cromatografia?

Uma das formas mais comuns de medir os canabinoides nas suas formas ácidas e neutras é a cromatografia. A cromatografia é uma técnica de separação, realizada em laboratórios com equipamento especializado, em que se isolam os analitos ou compostos químicos que compõem uma amostra, com o objetivo de os identificar.

Para a compreender melhor, podemos imaginar a cromatografia como uma corrida. A «pista» é a fase estacionária, que não se move e por onde passa a mistura que queremos analisar. Os «corredores» são a fase móvel, que se desloca pela pista ou fase estacionária. As substâncias canabinoides, tal como os corredores, movem-se de forma diferente consoante as suas propriedades físicas: algumas aderem mais à fase estacionária e movem-se mais lentamente, separando-se das que se movem mais depressa (tempo de retenção diferente). O mesmo aconteceria no símile da corrida: à medida que os corredores avançam pela pista, vão-se separando consoante a sua condição física.

Como funciona a cromatografia

1. Preparação da amostra: toda a cromatografia começa com uma mistura, que será a fase móvel. Esta é composta por um fluido solvente (que pode ser líquido ou gasoso) e, no caso da canábis, a mistura será composta pelas flores de canábis, o óleo de CBD, as guloseimas ou qualquer outro produto que consumimos e do qual queremos identificar e quantificar os canabinoides, que neste caso se chamam analitos. Estes analitos são os componentes que vão ser analisados, os compostos que se separam e medem durante a cromatografia. (A mesma técnica é utilizada para identificar terpenos, flavonoides e outros compostos, mas isso fica para outro texto.)
2. Injeção: a amostra é posta a circular sob pressão por uma coluna composta por um material sólido ou semissólido (fase estacionária).
3. Separação: cada um dos componentes da amostra difere no seu caudal, tamanho e polaridade, o que leva à sua separação quando fluem através da coluna (uns aderem mais do que outros).
4. Deteção: à medida que os componentes separados saem da coluna, passam por um detetor que regista a quantidade de cada um que sai. Isto faz-se geralmente medindo a quantidade de luz ultravioleta que cada componente absorve.
5. Análise de dados: os componentes separados são detetados e registados num computador, que gera um gráfico chamado cromatograma, cuja interpretação permite a identificação e a quantificação precisas dos diferentes canabinoides presentes.

Cromatografia gasosa: análise de canabinoides na sua forma neutra

A cromatografia gasosa (GC, pela sigla em inglês de Gas Chromatography) usa um gás como fase móvel e a separação ocorre numa coluna, que pode ser um tubo capilar. Nesta técnica é necessário usar aquecedores para ter uma amostra uniforme ao longo da coluna capilar.

A cromatografia gasosa só consegue medir canabinoides na sua forma neutra.

Como é necessário aquecer a amostra, a GC provoca a descarboxilação dos canabinoides na sua forma ácida. Por isso, quando se avaliam os canabinoides com esta técnica, só se pode fazê-lo com os canabinoides neutros, já que o calor descarboxila as formas ácidas. Esta pode ser uma das desvantagens da cromatografia gasosa.

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC): medição de canabinoides na forma ácida e neutra

A cromatografia líquida usa uma fase móvel líquida, em que também se pode usar uma coluna. Na indústria da canábis, uma das técnicas mais usadas é a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, de High Performance Liquid Chromatography, em inglês), em que partículas muito pequenas são empacotadas a alta pressão.

Ao contrário da cromatografia gasosa, a cromatografia líquida não requer o aquecimento da mistura e, por isso, pode ser usada para medir a concentração de diferentes canabinoides, como o CBD e o THC, mesmo na sua forma ácida. Isto torna-a o método de análise preferido para os produtos de canábis.

Na HPLC utilizam-se bombas para fazer passar este líquido pressurizado (solvente), que contém a mistura a analisar, pela coluna de HPLC. Cada um dos componentes da amostra difere no seu caudal, o que leva à sua separação quando fluem através da coluna.

Interpretação dos resultados da análise de canabinoides por HPLC

A figura seguinte mostra o resultado de uma análise de canabinoides por HPLC [1]. Este tipo de gráfico, chamado cromatograma, mostra o tempo no eixo X e a intensidade do sinal do detetor no eixo Y. Cada pico no gráfico representa um componente diferente da amostra, e a área sob o pico pode ser usada para determinar a quantidade desse componente na amostra.

O eixo X (eixo horizontal) mostra o tempo de separação de cada um dos analitos; por isso, a unidade são os minutos. Como podem observar, cada um dos analitos, que neste caso são canabinoides, difere no tempo (o número de minutos) que demora a passar pela fase líquida.

O eixo Y (eixo vertical) representa a intensidade do sinal, uma medida de absorvância cuja unidade é a AU (Absorbance Unit, em inglês), e quantifica a quantidade do analito. Esta medida tem origem na quantidade de absorção de luz, ou seja, em quanta luz absorve cada um dos analitos. Quanto maior for o pico no eixo Y, maior é a intensidade e, por isso, mais desse analito está presente na amostra e maior é a sua área sob a curva. Na figura seguinte, a unidade no eixo Y é a mAU (milli-Absorbance Units), que é a milésima parte da Absorbance Unit.

Cada um dos canabinoides tem um tempo de retenção próprio, o que nos permite diferenciá-los numa cromatografia. Quanto mais alto for o pico, maior a concentração desse canabinoide na amostra.

Assim, o resultado da cromatografia diz-nos, num determinado tempo (eixo X), se um analito está (ou não) presente com uma determinada intensidade (eixo Y). No nosso caso, cada um dos canabinoides tem um tempo de retenção próprio e, quanto mais desse canabinoide houver na amostra, maior é o valor no eixo Y.

É por isso que, para conseguir diferenciar cada um dos canabinoides no cromatograma, é preciso ter um padrão para saber o tempo de retenção específico de cada um dos analitos (canabinoides). O eixo Y é uma medida de fluorescência única para cada um dos canabinoides e é por esta razão que é preciso um padrão, como guia, para saber que canabinoide corresponde a esse pico em particular.

Demorei bastante tempo a perceber o que representam os dois primeiros picos da figura anterior e tive de perguntar a colegas especialistas na área, que me explicaram que o primeiro pico, que não tem nome na figura, é produzido pela injeção da fase líquida e corresponde às moléculas que não interagem na coluna; chama-se frente do solvente (solvent front, em inglês).

O tempo inicial antes do pico da frente do solvente é o tempo de que esta fase móvel precisa para atravessar a coluna e chama-se volume morto (dead volume, em inglês).

O segundo pico, a que a figura chama «I.S», é o do padrão (internal standard, IS, em inglês), que, no caso do artigo, foi a 4-androsteno-3,17-diona (4-androstene-3,17-dione). O pico deste composto químico no cromatograma serve de referência para calcular a quantidade de canabinoides presentes na amostra.

Espetrometria de massa (MS): determinação do peso molecular dos canabinoides

A espetrometria de massa (MS, pela sigla em inglês) separa partículas como átomos e moléculas, diferenciando a razão entre a sua carga e a sua massa. Esta técnica é usada para determinar o peso das partículas e é uma ferramenta analítica que mede a razão entre a massa e a carga (m/z) de uma ou mais moléculas presentes na amostra.

Estas medidas podem ser usadas para calcular o peso molecular exato dos componentes da amostra. A espetrometria de massa pode identificar compostos desconhecidos determinando o seu peso molecular, e também é usada para quantificar compostos conhecidos e determinar a estrutura dos componentes e moléculas presentes.

A técnica combinada GC-MS: mais precisão na determinação de canabinoides

Uma das técnicas mais usadas atualmente para a determinação de canabinoides é a combinação da cromatografia gasosa com a espetrometria de massa (GC-MS, pela sigla em inglês).

Assim, combina-se a capacidade da cromatografia gasosa para separar os componentes de uma amostra com a capacidade da espetrometria de massa para identificar e quantificar os componentes individuais. O resultado é muito sensível e preciso na medição da quantidade e do tipo de canabinoides presentes na amostra.

Em conclusão…

Bem, aqui vos deixo a informação básica sobre as diferentes técnicas que se usam atualmente para medir canabinoides na indústria da canábis. Se houver algum leitor químico, gostava muito de saber o que acham desta informação de química elementar.