Zastanawiałeś się kiedyś, jak określa się poziomy CBD, THC i innych kannabinoidów w marihuanie lub w olejkach CBD? W tym wpisie wyjaśnimy naukę stojącą za metodami pozwalającymi ilościowo oznaczać kannabinoidy, takimi jak chromatografia gazowa, HPLC i spektrometria mas, oraz to, jak techniki te są stosowane łącznie do analizy składników konopi.
Wprowadzenie do analizy kannabinoidów
Analiza kannabinoidów służy różnym celom, zarówno terapeutycznym, jak i regulacyjnym. Jej głównym zadaniem jest określenie mocy i jakości produktów konopnych, ale można jej też użyć do prawnej klasyfikacji próbki jako „konopi przemysłowych” lub „marihuany” na podstawie zawartości THC. Jest więc bardzo przydatnym narzędziem zarówno dla konsumentów, jak i dla profesjonalistów z branży konopnej.
Czym są kannabinoidy i jak powstają w roślinie?
Kannabinoidy to rodzaj związków chemicznych występujących głównie w roślinie Cannabis sativa. Powstają one w trichomach, bardzo małych strukturach gruczołowych, które znajdują się przede wszystkim na kwiatach konopi roślin żeńskich, lepiej znanych jako szyszki marihuany.
Cechą szczególną kannabinoidów jest to, że roślina produkuje je w postaci kwasowej, oznaczanej literą „A” na końcu skrótu. Dlatego jednymi z najbardziej znanych związków kwasowych są kwas Δ-9-tetrahydrokannabinolowy (THCA) i kwas kannabidiolowy (CBDA).
Gdy kannabinoidy się podgrzewa, przechodzą w formy neutralne, czyli kannabinoidy, które wszyscy znamy lub najpopularniejsze, takie jak tetrahydrokannabinol (THC) i kannabidiol (CBD). Dzieje się tak pod wpływem ogrzewania, przez utratę dwutlenku węgla (CO2), w procesie zwanym dekarboksylacją.
Te kwasowe i neutralne formy kannabinoidów można mierzyć na różne sposoby, a w tym tekście wyjaśnię Ci niektóre z nich.
Zrozumieć chromatografię: kluczowe narzędzie w analizie kannabinoidów
Czym jest chromatografia?
Jednym z najczęstszych sposobów mierzenia kannabinoidów w ich formach kwasowych i neutralnych jest chromatografia. Chromatografia to technika rozdziału, wykonywana w laboratoriach na specjalistycznym sprzęcie, w której izoluje się anality, czyli związki chemiczne składające się na próbkę, aby je zidentyfikować.
Aby lepiej to zrozumieć, możemy wyobrazić sobie chromatografię jako wyścig. „Tor” to faza stacjonarna, która się nie porusza i przez którą przechodzi mieszanina, którą chcemy przeanalizować. „Zawodnicy” to faza ruchoma, która przemieszcza się po torze, czyli fazie stacjonarnej. Substancje kannabinoidowe, jak zawodnicy, poruszają się w różny sposób w zależności od swoich właściwości fizycznych: niektóre przywierają bardziej do fazy stacjonarnej i poruszają się wolniej, oddzielając się od tych, które poruszają się szybciej (inny czas retencji). To samo dzieje się w porównaniu z wyścigiem: gdy zawodnicy posuwają się po torze, będą się rozdzielać zgodnie ze swoją kondycją fizyczną.
Jak działa chromatografia
- Przygotowanie próbki: Każda chromatografia zaczyna się od mieszaniny, która będzie fazą ruchomą. Składa się ona z płynnego rozpuszczalnika (który może być ciekły lub gazowy), a w przypadku marihuany mieszanina będzie złożona z kwiatów konopi, olejku CBD, słodyczy lub dowolnego innego produktu, który spożywamy i w którym chcemy zidentyfikować i oznaczyć ilościowo kannabinoidy, które w tym przypadku nazywa się analitami. Te anality to składniki, które będą analizowane, czyli związki, które są rozdzielane i mierzone podczas chromatografii. (Ta sama technika służy do identyfikacji terpenów, flawonoidów i innych związków, ale to historia na inny tekst).
- Wstrzyknięcie: Próbkę przepuszcza się pod ciśnieniem przez kolumnę złożoną z materiału stałego lub półstałego (faza stacjonarna).
- Rozdział: Każdy ze składników próbki różni się szybkością przepływu, wielkością i polarnością, co prowadzi do ich rozdzielenia, gdy przepływają przez kolumnę (jedne przywierają bardziej niż inne).
- Detekcja: Gdy rozdzielone składniki opuszczają kolumnę, przechodzą przez detektor, który rejestruje ilość każdego z nich. Zazwyczaj robi się to, mierząc ilość światła ultrafioletowego, które pochłania każdy składnik.
- Analiza danych: Rozdzielone składniki są wykrywane i rejestrowane w komputerze, który generuje wykres zwany chromatogramem, którego interpretacja pozwala na precyzyjną identyfikację i oznaczenie ilościowe poszczególnych obecnych kannabinoidów.
Chromatografia gazowa: analiza kannabinoidów w formie neutralnej
Chromatografia gazowa (GC, od angielskiego Gas Chromatography) wykorzystuje gaz jako fazę ruchomą, a rozdział zachodzi w kolumnie, którą może być rurka kapilarna. W tej technice konieczne jest użycie grzałek, aby uzyskać jednolitą próbkę na całej długości kolumny kapilarnej.
Chromatografia gazowa może mierzyć kannabinoidy tylko w ich formie neutralnej.
Ponieważ próbkę trzeba podgrzać, GC powoduje dekarboksylację kannabinoidów w formie kwasowej. Dlatego przy ocenie kannabinoidów tą techniką można mierzyć tylko kannabinoidy neutralne, ponieważ ciepło dekarboksyluje formy kwasowe. Może to być jedna z wad chromatografii gazowej.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC): pomiar kannabinoidów w formie kwasowej i neutralnej
Chromatografia cieczowa wykorzystuje ciekłą fazę ruchomą, w której także można użyć kolumny. W branży konopnej jedną z najczęściej stosowanych technik jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC, od High Performance Liquid Chromatography, po angielsku), w której bardzo małe cząstki upakowuje się pod wysokim ciśnieniem.
W przeciwieństwie do chromatografii gazowej chromatografia cieczowa nie wymaga podgrzewania mieszaniny, dlatego można jej użyć do pomiaru stężenia różnych kannabinoidów, takich jak CBD i THC, także w ich formie kwasowej. To czyni ją preferowaną metodą analizy produktów konopnych.
W HPLC stosuje się pompy, które przepuszczają ten pod ciśnieniem ciekły rozpuszczalnik zawierający analizowaną mieszaninę przez kolumnę HPLC. Każdy ze składników próbki różni się szybkością przepływu, co prowadzi do ich rozdzielenia, gdy przepływają przez kolumnę.
Interpretacja wyników analizy kannabinoidów w HPLC
Poniższy rysunek pokazuje wynik analizy kannabinoidów z użyciem HPLC [1]. Ten rodzaj wykresu, zwany chromatogramem, pokazuje czas na osi X i intensywność sygnału detektora na osi Y. Każdy pik na wykresie reprezentuje inny składnik próbki, a pole pod pikiem można wykorzystać do określenia ilości tego składnika w próbce.
Oś X (oś pozioma) pokazuje czas rozdziału każdego z analitów, a zatem jednostką są minuty. Jak możesz zauważyć, każdy z analitów, którymi w tym przypadku są kannabinoidy, różni się czasem (liczbą minut), jaki zajmuje mu przejście przez fazę ciekłą.
Oś Y (oś pionowa) przedstawia intensywność sygnału, miarę absorbancji, której jednostką jest AU (Absorbance Unit, po angielsku) i która określa ilość analitu. Ta miara wywodzi się z ilości pochłanianego światła, czyli tego, ile światła pochłania każdy z analitów. Im większy pik na osi Y, tym większa intensywność, a więc tym więcej tego analitu jest obecne w próbce i tym większe jest jego pole pod krzywą. Na poniższym rysunku jednostką na osi Y jest mAU (milli-Absorbance Units), czyli jedna tysięczna Absorbance Unit.
Każdy z kannabinoidów ma określony czas retencji, co pozwala nam odróżnić je w chromatografii. Im wyższy pik, tym większe stężenie tego kannabinoidu w próbce.
Zatem wynik chromatografii mówi nam, w określonym czasie (oś X), czy dany analit jest (lub nie) obecny z określoną intensywnością (oś Y). W naszym przypadku każdy z kannabinoidów ma określony czas retencji, a im więcej danego kannabinoidu jest w próbce, tym większa wartość na osi Y.
Dlatego aby odróżnić poszczególne kannabinoidy na chromatogramie, potrzebny jest wzorzec , dzięki któremu znamy konkretny czas retencji każdego z analitów (kannabinoidów). Oś Y jest miarą fluorescencji unikalną dla każdego z kannabinoidów, dlatego potrzebny jest wzorzec (in standard) jako przewodnik, by wiedzieć, który kannabinoid przypada na dany pik.
Ustalenie, co przedstawiają dwa pierwsze piki na powyższym rysunku, zajęło mi sporo czasu i wymagało dopytania kolegów ekspertów z tej dziedziny, którzy wyjaśnili mi, że pierwszy pik, który nie ma nazwy na rysunku, powstaje przez wstrzyknięcie fazy ciekłej i są to cząsteczki, które nie oddziałują w kolumnie; nazywa się go frontem rozpuszczalnika (solvent front, po angielsku).
Czas początkowy przed pikiem frontu rozpuszczalnika to czas, którego ta faza ruchoma potrzebuje na przejście przez kolumnę, i nazywa się go objętością martwą (dead volume, po angielsku).
Drugi pik, który na rysunku nazwano „I.S”, to pik wzorca (internal standard, IS, po angielsku), którym w przypadku artykułu było 4-androsteno-3,17-dion (4-androstene-3,17-dione). Pik tego związku chemicznego na chromatogramie służy jako punkt odniesienia do obliczenia ilości kannabinoidów obecnych w próbce.
Spektrometria mas (MS): określanie masy cząsteczkowej kannabinoidów
Spektrometria mas (MS, od angielskiego skrótu) rozdziela cząstki, takie jak atomy i cząsteczki, rozróżniając stosunek ich ładunku do masy. Technika ta służy do określania masy cząstek i jest narzędziem analitycznym mierzącym stosunek masy do ładunku (m/z) jednej lub kilku cząsteczek obecnych w próbce.
Pomiary te można wykorzystać do obliczenia dokładnej masy cząsteczkowej składników próbki. Spektrometria mas może identyfikować nieznane związki, określając ich masę cząsteczkową, a także służy do oznaczania ilościowego znanych związków i ustalania struktury obecnych składników i cząsteczek.
Technika łączona GC-MS: większa precyzja w oznaczaniu kannabinoidów
Jedną z najczęściej stosowanych obecnie technik oznaczania kannabinoidów jest połączenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS, od angielskiego skrótu).
Łączy się więc zdolność chromatografii gazowej do rozdzielania składników próbki ze zdolnością spektrometrii mas do identyfikacji i oznaczania ilościowego poszczególnych składników. Wynik jest bardzo czuły i precyzyjny pod względem pomiaru ilości i rodzaju kannabinoidów obecnych w próbce.
Podsumowując…
Oto podstawowe informacje o różnych technikach, które obecnie służą do pomiaru kannabinoidów w branży konopnej. Jeśli wśród czytelników jest jakiś chemik, z wielką przyjemnością dowiem się, co sądzisz o tych informacjach z podstaw chemii.
Bibliografia
- Gul, W., et al., Determination of 11 cannabinoids in biomass and extracts of different varieties of Cannabis using high-performance liquid chromatography. Journal of AOAC International, 2015. 98(6): p. 1523-1528.
