Hoe wordt een cannabinoïdenanalyse uitgevoerd?

Heb je je ooit afgevraagd hoe het gehalte aan CBD, THC en andere cannabinoïden in wiet of in CBD-olie wordt bepaald? In dit artikel leggen we de wetenschap uit achter de methoden waarmee cannabinoïden worden gekwantificeerd, zoals gaschromatografie, HPLC en massaspectrometrie, en hoe deze technieken samen worden gebruikt om de bestanddelen van cannabis te analyseren.

Inleiding tot de cannabinoïdenanalyse

Cannabinoïdenanalyse wordt voor verschillende doeleinden gebruikt, zowel therapeutische als regelgevende. Het belangrijkste doel is om de potentie en kwaliteit van cannabisproducten te bepalen, maar ze kan ook worden gebruikt om een monster wettelijk te classificeren als “hennep” of “wiet”, op basis van het THC-gehalte. Zo is het een heel nuttig hulpmiddel voor zowel consumenten als professionals in de cannabisindustrie.

Wat zijn cannabinoïden en hoe worden ze in de plant gevormd?

Cannabinoïden zijn een soort chemische verbindingen die vooral voorkomen in de Cannabis sativa-plant. Ze worden gevormd in de trichomen, zeer kleine klierstructuren die je vooral vindt op de cannabisbloemen van vrouwelijke planten, beter bekend als de wiettoppen.

Een bijzonderheid van cannabinoïden is dat ze door de plant in hun zure vorm worden gemaakt, aangeduid met een “A” aan het eind van de afkorting. Daarom zijn enkele van de bekendste zure verbindingen Δ-9-tetrahydrocannabinolzuur (THCA) en cannabidiolzuur (CBDA).

Wanneer cannabinoïden worden verhit, gaan ze over in hun neutrale vorm: de cannabinoïden die we allemaal kennen of die het populairst zijn, zoals tetrahydrocannabinol (THC) en cannabidiol (CBD). Dat gebeurt bij verhitting, doordat ze kooldioxide (CO2) verliezen, in een proces dat decarboxylatie heet.

Deze zure en neutrale vormen van cannabinoïden kunnen op verschillende manieren worden gemeten, en in dit artikel leg ik er een aantal uit.

Chromatografie begrijpen: een belangrijk hulpmiddel bij cannabinoïdenanalyse

Wat is chromatografie?

Een van de meest gebruikte manieren om cannabinoïden in hun zure en neutrale vorm te meten is chromatografie. Chromatografie is een scheidingstechniek, uitgevoerd in laboratoria met gespecialiseerde apparatuur, waarbij de analyten of chemische verbindingen waaruit een monster bestaat worden geïsoleerd om ze te identificeren.

Om het beter te begrijpen kunnen we chromatografie voorstellen als een hardloopwedstrijd. De “baan” is de stationaire fase, die niet beweegt en waar het mengsel dat we willen analyseren doorheen gaat. De “lopers” zijn de mobiele fase, die zich over de baan, oftewel de stationaire fase, verplaatst. Net als de lopers bewegen cannabinoïde stoffen verschillend, afhankelijk van hun fysische eigenschappen: sommige hechten zich sterker aan de stationaire fase en bewegen langzamer, waardoor ze zich scheiden van de stoffen die sneller bewegen (verschillende retentietijd). Hetzelfde zou gebeuren in de vergelijking met de wedstrijd: naarmate de lopers over de baan vorderen, raken ze van elkaar gescheiden op basis van hun conditie.

Hoe chromatografie werkt

1. Monstervoorbereiding: elke chromatografie begint met een mengsel, dat de mobiele fase wordt. Dit bestaat uit een oplosmiddel (dat vloeibaar of gasvormig kan zijn) en, in het geval van wiet, bestaat het mengsel uit de cannabisbloemen, de CBD-olie, snoepjes of elk ander product dat we gebruiken en waarvan we de cannabinoïden willen identificeren en kwantificeren, die in dit geval analyten heten. Deze analyten zijn de bestanddelen die worden geanalyseerd: de verbindingen die tijdens de chromatografie worden gescheiden en gemeten. (Dezelfde techniek wordt gebruikt om terpenen, flavonoïden en andere verbindingen te identificeren, maar dat is een verhaal voor een ander artikel.)
2. Injectie: het monster wordt onder druk door een kolom geleid die bestaat uit een vast of halfvast materiaal (stationaire fase).
3. Scheiding: de bestanddelen van het monster verschillen in stroomsnelheid, grootte en polariteit, waardoor ze van elkaar gescheiden raken terwijl ze door de kolom stromen (sommige hechten zich sterker dan andere).
4. Detectie: wanneer de gescheiden bestanddelen de kolom verlaten, passeren ze een detector die registreert hoeveel er van elk bestanddeel naar buiten komt. Meestal gebeurt dat door te meten hoeveel ultraviolet licht elk bestanddeel absorbeert.
5. Gegevensanalyse: de gescheiden bestanddelen worden gedetecteerd en vastgelegd op een computer, die een grafiek maakt die chromatogram heet. De interpretatie daarvan maakt een nauwkeurige identificatie en kwantificering van de verschillende aanwezige cannabinoïden mogelijk.

Gaschromatografie: analyse van cannabinoïden in hun neutrale vorm

Gaschromatografie (GC, naar het Engelse Gas Chromatography) gebruikt gas als mobiele fase en de scheiding vindt plaats in een kolom, die een capillaire buis kan zijn. Bij deze techniek zijn verwarmingselementen nodig om over de hele capillaire kolom een gelijkmatig monster te hebben.

Gaschromatografie kan cannabinoïden alleen in hun neutrale vorm meten.

Omdat het monster verhit moet worden, zet GC de cannabinoïden in hun zure vorm aan tot decarboxylatie. Wanneer cannabinoïden met deze techniek worden onderzocht, kan dat dus alleen met de neutrale cannabinoïden, omdat de hitte de zure vormen decarboxyleert. Dat kan een van de nadelen van gaschromatografie zijn.

Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC): meting van cannabinoïden in zure en neutrale vorm

Vloeistofchromatografie gebruikt een vloeibare mobiele fase, waarbij ook een kolom kan worden gebruikt. In de cannabisindustrie is een van de meest gebruikte technieken hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC, naar het Engelse High Performance Liquid Chromatography), waarbij zeer kleine deeltjes onder hoge druk worden gepakt.

Anders dan bij gaschromatografie hoeft het mengsel bij vloeistofchromatografie niet te worden verhit. Daarom kan ze worden gebruikt om de concentratie van verschillende cannabinoïden te meten, zoals CBD en THC, zelfs in hun zure vorm. Dat maakt het de voorkeursmethode voor de analyse van cannabisproducten.

Bij HPLC worden pompen gebruikt om deze vloeistof onder druk (het oplosmiddel), met daarin het te analyseren mengsel, door de HPLC-kolom te sturen. De bestanddelen van het monster verschillen in stroomsnelheid, waardoor ze van elkaar gescheiden raken terwijl ze door de kolom stromen.

Interpretatie van de resultaten van een cannabinoïdenanalyse met HPLC

De figuur hieronder toont het resultaat van een cannabinoïdenanalyse met HPLC [1]. Dit type grafiek, een chromatogram, toont de tijd op de X-as en de sterkte van het detectorsignaal op de Y-as. Elke piek in de grafiek staat voor een ander bestanddeel van het monster, en de oppervlakte onder de piek kan worden gebruikt om de hoeveelheid van dat bestanddeel in het monster te bepalen.

De X-as (horizontale as) toont de scheidingstijd van elk van de analyten; de eenheid is dus minuten. Zoals jullie kunnen zien, verschillen de analyten, in dit geval cannabinoïden, in de tijd (het aantal minuten) die ze nodig hebben om door de vloeibare fase te gaan.

De Y-as (verticale as) geeft de signaalintensiteit weer, een maat voor absorptie met als eenheid de AU (Absorbance Unit in het Engels), en kwantificeert de hoeveelheid analyt. Deze maat is gebaseerd op de hoeveelheid lichtabsorptie, dat wil zeggen hoeveel licht elk van de analyten absorbeert. Hoe hoger de piek op de Y-as, hoe hoger de intensiteit, en dus hoe meer van die analyt er in het monster aanwezig is en hoe groter de oppervlakte onder de curve. In de figuur hieronder is de eenheid op de Y-as mAU (milli-Absorbance Units), een duizendste van de Absorbance Unit.

Elke cannabinoïde heeft een eigen retentietijd, waardoor we ze in een chromatografie van elkaar kunnen onderscheiden. Hoe hoger de piek, hoe hoger de concentratie van die cannabinoïde in het monster.

Het resultaat van de chromatografie vertelt ons dus of een analyt op een bepaald tijdstip (X-as) wel of niet aanwezig is bij een bepaalde intensiteit (Y-as). In ons geval heeft elke cannabinoïde een eigen retentietijd, en hoe meer er van die specifieke cannabinoïde in het monster zit, hoe hoger de waarde op de Y-as.

Daarom heb je, om de cannabinoïden in het chromatogram van elkaar te kunnen onderscheiden, een standaard nodig om de specifieke retentietijd van elk van de analyten (cannabinoïden) te kennen. De Y-as is een fluorescentiemaat die voor elke cannabinoïde uniek is; daarom is er een standaard nodig, als leidraad, om te weten welke cannabinoïde bij die specifieke piek hoort.

Het heeft me behoorlijk wat tijd gekost om uit te zoeken wat de eerste twee pieken in de figuur hierboven voorstellen, en ik moest het navragen bij collega’s die deskundig zijn op dit gebied. Zij legden me uit dat de eerste piek, die in de figuur geen naam heeft, ontstaat door de injectie van de vloeibare fase en bestaat uit de moleculen die in de kolom geen interactie aangaan; dat heet het oplosmiddelfront (solvent front in het Engels).

De tijd vóór de piek van het oplosmiddelfront is de tijd die deze mobiele fase nodig heeft om door de kolom te gaan, en heet het dode volume (dead volume in het Engels).

De tweede piek, die in de figuur “I.S” heet, is die van de standaard (internal standard, IS, in het Engels); in het artikel gebruikten ze daarvoor 4-androsteen-3,17-dion (4-androstene-3,17-dione). De piek van deze chemische verbinding in het chromatogram dient als referentie om de hoeveelheid cannabinoïden in het monster te berekenen.

Massaspectrometrie (MS): bepaling van het molecuulgewicht van cannabinoïden

Massaspectrometrie (MS, naar de Engelse afkorting) scheidt deeltjes zoals atomen en moleculen door de verhouding tussen hun lading en hun massa te onderscheiden. Deze techniek wordt gebruikt om het gewicht van deeltjes te bepalen en is een analytisch hulpmiddel dat de verhouding tussen massa en lading (m/z) meet van een of meer moleculen in het monster.

Met deze metingen kun je het exacte molecuulgewicht berekenen van de bestanddelen van het monster. Massaspectrometrie kan onbekende verbindingen identificeren door hun molecuulgewicht te bepalen, en wordt ook gebruikt om bekende verbindingen te kwantificeren en de structuur van de aanwezige bestanddelen en moleculen te bepalen.

De gecombineerde techniek GC-MS: een nauwkeurigere bepaling van cannabinoïden

Een van de technieken die momenteel het meest worden gebruikt om cannabinoïden te bepalen, is de combinatie van gaschromatografie met massaspectrometrie (GC-MS, naar de Engelse afkorting).

Zo combineer je het vermogen van gaschromatografie om de bestanddelen van een monster te scheiden met het vermogen van massaspectrometrie om de afzonderlijke bestanddelen te identificeren en te kwantificeren. Het resultaat is zeer gevoelig en nauwkeurig bij het meten van de hoeveelheid en het soort cannabinoïden in het monster.

Tot slot…

Nou, hier hebben jullie de basisinformatie over de verschillende technieken die momenteel in de cannabisindustrie worden gebruikt om cannabinoïden te meten. Als er scheikundigen onder de lezers zijn, hoor ik graag wat jullie van deze elementaire scheikundige informatie vinden.