Ti sei mai chiesto come si determinano i livelli di CBD, THC e altri cannabinoidi nella cannabis o negli oli CBD? In questo post ti spieghiamo la scienza alla base dei metodi che permettono di quantificare i cannabinoidi, come la gascromatografia, l'HPLC e la spettrometria di massa, e come queste tecniche vengono utilizzate insieme per analizzare i componenti della cannabis.
Introduzione all'analisi dei cannabinoidi
L'analisi dei cannabinoidi viene utilizzata per diversi scopi, sia terapeutici che normativi. Il suo scopo principale è determinare la potenza e la qualità dei prodotti a base di cannabis, ma può essere utilizzata anche per classificare legalmente un campione come «canapa» o «marijuana», in base al suo contenuto di THC. È quindi uno strumento molto utile sia per i consumatori che per i professionisti del settore della cannabis.
Cosa sono i cannabinoidi e come vengono prodotti nella pianta?
I cannabinoidi sono una classe di composti chimici che si trovano prevalentemente nella pianta di Cannabis sativa. Questi si formano nei tricomi, strutture ghiandolari molto piccole che si trovano soprattutto nei fiori di cannabis delle piante femmina, meglio conosciuti come infiorescenze di marijuana.
Una particolarità dei cannabinoidi è che vengono prodotti dalla pianta nella loro forma acida, indicata con una «A» alla fine della sigla. Ecco perché alcuni dei composti acidi più noti sono l'acido Δ-9-tetraidrocannabinolico (THCA) e l'acido cannabidiolico (CBDA).
Quando i cannabinoidi vengono riscaldati, passano alle forme neutre, i cannabinoidi che tutti conosciamo o più popolari, come il tetraidrocannabinolo (THC) e il cannabidiolo (CBD). Questo avviene con il riscaldamento, perdendo anidride carbonica (CO2), in un processo chiamato decarbossilazione.
Queste forme acide e neutre dei cannabinoidi si possono misurare in diversi modi, e in questo articolo te ne spiegherò alcuni.
Comprendere la cromatografia: uno strumento chiave nell'analisi dei cannabinoidi
Che cos'è la cromatografia?
Uno dei metodi più comuni per misurare i cannabinoidi nelle loro forme acide e neutre è la cromatografia. La cromatografia è una tecnica di separazione, eseguita in laboratorio con apparecchiature specializzate, in cui vengono isolati gli analiti o composti chimici che compongono un campione, al fine di identificarli.
Per capirla meglio, possiamo immaginare la cromatografia come una gara di corsa. La «pista» è la fase stazionaria, che non si muove e attraverso la quale passa la miscela che vogliamo analizzare. I «corridori» sono la fase mobile, che si sposta lungo la pista o fase stazionaria. Le sostanze cannabinoidi, come i corridori, si muovono in modo diverso a seconda delle loro proprietà fisiche: alcune aderiscono di più alla fase stazionaria e si muovono più lentamente, separandosi da quelle che si muovono più velocemente (diverso tempo di ritenzione). Lo stesso succederebbe nella similitudine della gara: man mano che i corridori avanzano lungo la pista, si andranno separando in base alla loro condizione fisica.
Come funziona la cromatografia
- Preparazione del campione: ogni cromatografia inizia con una miscela, che sarà la fase mobile. Questa è composta da un fluido solvente (che può essere liquido o gassoso) e, nel caso della cannabis, la miscela sarà composta dai fiori di cannabis, dall'olio CBD, dalle caramelle o da qualsiasi altro prodotto che consumiamo e di cui vogliamo identificare e quantificare i cannabinoidi, che in questo caso si chiamano analiti. Questi analiti sono i componenti da analizzare, cioè i composti che vengono separati e misurati durante la cromatografia. (La stessa tecnica si usa per identificare terpeni, flavonoidi e altri composti, ma questa è una storia per un altro articolo).
- Iniezione: il campione viene fatto circolare sotto pressione attraverso una colonna costituita da un materiale solido o semisolido (fase stazionaria).
- Separazione: ciascuno dei componenti del campione differisce per velocità di flusso, dimensioni e polarità, e questo porta a separarli mentre scorrono attraverso la colonna (alcuni aderiscono più di altri).
- Rilevazione: man mano che i componenti separati escono dalla colonna, passano attraverso un rivelatore che registra la quantità di ciascuno di essi. Di solito questo si fa misurando la quantità di luce ultravioletta assorbita da ciascun componente.
- Analisi dei dati: i componenti separati vengono rilevati e registrati su un computer, che genera un grafico chiamato cromatogramma, la cui interpretazione permette di identificare e quantificare con precisione i diversi cannabinoidi presenti.
Gascromatografia: analisi dei cannabinoidi nella loro forma neutra
La gascromatografia (GC, dalla sigla inglese di Gas Chromatography) usa il gas come fase mobile e la separazione avviene in una colonna, che può essere un tubo capillare. In questa tecnica è necessario usare dei riscaldatori per avere un campione uniforme lungo tutta la colonna capillare.
La gascromatografia può misurare i cannabinoidi solo nella loro forma neutra.
Poiché è necessario riscaldare il campione, la GC induce la decarbossilazione dei cannabinoidi nella loro forma acida. Pertanto, quando si valutano i cannabinoidi con questa tecnica, lo si può fare solo con i cannabinoidi neutri, perché il calore decarbossila le forme acide. Questo può essere uno degli svantaggi della gascromatografia.
Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC): misurazione dei cannabinoidi in forma acida e neutra
La cromatografia liquida usa una fase mobile liquida, e anche qui si può usare una colonna. Nel settore della cannabis, una delle tecniche più usate è la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC, dall'inglese High Performance Liquid Chromatography), in cui particelle molto piccole vengono impaccate ad alta pressione.
A differenza della gascromatografia, la cromatografia liquida non richiede il riscaldamento della miscela e può quindi essere usata per misurare la concentrazione di diversi cannabinoidi, come il CBD e il THC, anche nella loro forma acida. Questo la rende il metodo di analisi preferito per i prodotti a base di cannabis.
Nell'HPLC si usano delle pompe per far passare attraverso la colonna HPLC questo liquido pressurizzato (solvente) che contiene la miscela da analizzare. Ciascuno dei componenti del campione differisce per velocità di flusso, e questo porta a separarli mentre scorrono attraverso la colonna.
Interpretazione dei risultati dell'analisi dei cannabinoidi in HPLC
La figura seguente mostra il risultato di un'analisi dei cannabinoidi mediante HPLC [1]. Questo tipo di grafico, chiamato cromatogramma, mostra il tempo sull'asse X e l'intensità del segnale del rivelatore sull'asse Y. Ogni picco del grafico rappresenta un componente diverso del campione, e l'area sotto il picco può essere usata per determinare la quantità di quel componente nel campione.
L'asse X (asse orizzontale) mostra il tempo di separazione di ciascuno degli analiti, quindi l'unità di misura sono i minuti. Come puoi vedere, ciascuno degli analiti, che in questo caso sono cannabinoidi, differisce per il tempo (il numero di minuti) che impiega a passare attraverso la fase liquida.
L'asse Y (asse verticale) rappresenta l'intensità del segnale, una misura di assorbanza la cui unità è l'AU (Absorbance Unit, in inglese), e quantifica la quantità di analita. Questa misura ha origine dalla quantità di luce assorbita, cioè da quanta luce assorbe ciascuno degli analiti. Più alto è il picco sull'asse Y, maggiore è l'intensità, e quindi più analita è presente nel campione e maggiore è la sua area sotto la curva. Nella figura qui sotto l'unità sull'asse Y è il mAU (milli-Absorbance Units), che è un millesimo dell'Absorbance Unit.
Ciascuno dei cannabinoidi ha un tempo di ritenzione specifico, che ci permette di distinguerli in una cromatografia. Più alto è il picco, maggiore è la concentrazione di quel cannabinoide nel campione.
Quindi, il risultato della cromatografia ci dice, in un determinato tempo (asse X), se un analita è presente (o no) con una determinata intensità (asse Y). Nel nostro caso, ciascuno dei cannabinoidi ha un tempo di ritenzione specifico e, quanto più di quel particolare cannabinoide c'è nel campione, tanto maggiore è il valore sull'asse Y.
Per questo, per poter distinguere ciascuno dei cannabinoidi nel cromatogramma, è necessario disporre di uno standard che indichi il tempo di ritenzione specifico di ciascuno degli analiti (cannabinoidi). L'asse Y è una misura di fluorescenza unica per ciascuno dei cannabinoidi: è per questo che serve uno standard, come guida, per sapere quale cannabinoide corrisponde a quel picco in particolare.
Mi ci è voluto parecchio tempo per capire cosa rappresentano i primi due picchi della figura precedente, e ho dovuto informarmi presso colleghi esperti del settore, che mi hanno spiegato che il primo picco, che nella figura non ha nome, è prodotto dall'iniezione della fase liquida e corrisponde alle molecole che non interagiscono nella colonna: si chiama fronte del solvente (solvent front, in inglese).
Il tempo iniziale prima del picco del fronte del solvente è il tempo di cui questa fase mobile ha bisogno per attraversare la colonna e si chiama volume morto (dead volume, in inglese).
Il secondo picco, che nella figura si chiama «I.S», è quello dello standard (internal standard, IS, in inglese), che nel caso dell'articolo era il 4-androstene-3,17-dione (4-androstene-3,17-dione). Il picco di questo composto chimico nel cromatogramma serve da riferimento per calcolare la quantità di cannabinoidi presenti nel campione.
Spettrometria di massa (MS): determinazione del peso molecolare dei cannabinoidi
La spettrometria di massa (MS, dalla sigla inglese) separa particelle come atomi e molecole distinguendone il rapporto tra carica e massa. Questa tecnica si usa per determinare il peso delle particelle ed è uno strumento analitico che misura il rapporto tra la massa e la carica (m/z) di una o più molecole presenti nel campione.
Queste misure si possono usare per calcolare il peso molecolare esatto dei componenti del campione. La spettrometria di massa può identificare composti sconosciuti determinandone il peso molecolare, e si usa anche per quantificare composti noti e determinare la struttura dei componenti e delle molecole presenti.
La tecnica combinata GC-MS: più precisione nella determinazione dei cannabinoidi
Una delle tecniche oggi più usate per la determinazione dei cannabinoidi è la combinazione della gascromatografia con la spettrometria di massa (GC-MS, dalla sigla inglese).
Si combinano così la capacità della gascromatografia di separare i componenti di un campione e la capacità della spettrometria di massa di identificare e quantificare i singoli componenti. Il risultato è molto sensibile e preciso nel misurare la quantità e il tipo di cannabinoidi presenti nel campione.
In conclusione…
Bene, eccoti le informazioni di base sulle diverse tecniche che oggi si usano per misurare i cannabinoidi nel settore della cannabis. Se sei un chimico e stai leggendo, mi piacerebbe sapere cosa ne pensi di queste informazioni di chimica elementare.
Bibliografia
- Gul, W., et al., Determination of 11 cannabinoids in biomass and extracts of different varieties of Cannabis using high-performance liquid chromatography. Journal of AOAC International, 2015. 98(6): p. 1523-1528.
