Como é efectuada uma análise de canabinóides?

Análise de canabinóides

Já alguma vez se interrogou sobre como são determinados os níveis de CBD, THC e outros canabinóides na marijuana ou nos óleos de CBD? Nesta publicação, explicaremos a ciência subjacente aos métodos que permitem quantificar os canabinóides, como a cromatografia gasosa, a HPLC e a espetrometria de massa, e como estas técnicas são utilizadas em conjunto para analisar os componentes da canábis.

Introdução à análise de canabinóides

A análise de canabinóides é utilizada para uma variedade de objectivos, tanto terapêuticos como regulamentares. O seu principal objetivo é determinar a potência e a qualidade dos produtos de canábis, mas também pode ser utilizado para classificar legalmente uma amostra como “cânhamo” ou “marijuana” com base no seu teor de THC. Trata-se, portanto, de uma ferramenta muito útil tanto para os consumidores como para os profissionais da indústria da canábis.

O que são canabinóides e como são produzidos na planta?

Os canabinóides são uma classe de compostos químicos que se encontram predominantemente na planta Cannabis sativa . Estes formam-se nos tricomas, estruturas glandulares muito pequenas que se encontram sobretudo nas flores de canábis das plantas femininas, mais conhecidas como botões de marijuana .

Uma particularidade dos canabinóides é o facto de serem produzidos pela planta na sua forma ácida, expressa com um “A” no final do acrónimo. É por isso que alguns dos compostos ácidos mais conhecidos são o ácido Δ-9-tetrahidrocanabinol (THCA) e o ácido canabidiólico (CBDA).

Quando os canabinóides são aquecidos, transformam-se nas formas neutras, os canabinóides que todos conhecemos ou os mais populares, como o tetrahidrocanabinol (THC) y canabidiol ( CBD ). Isto ocorre com o aquecimento, uma vez que o dióxido de carbono(CO2) é perdido, num processo chamado descarboxilação .

Estas formas ácidas e neutras de canabinóides podem ser medidas de diferentes formas e, neste artigo, explicarei algumas delas.

Compreender a cromatografia: uma ferramenta fundamental na análise de canabinóides

O que é a cromatografia?

Uma das formas mais comuns de medir os canabinóides nas suas formas ácida e neutra é a cromatografia. A cromatografia é uma técnica de separação, efectuada em laboratórios com equipamento especializado, em que os analitos ou compostos químicos presentes numa amostra são isolados com o objetivo de os identificar.

Para o compreender melhor, podemos imaginar a cromatografia como uma corrida. A“pista” é a fase estacionária, que não se move e através da qual passa a mistura que queremos analisar. Os“corredores” são a fase móvel, que se desloca ao longo do trajeto ou fase estacionária. As substâncias canabinóides, tal como os corredores, movem-se de forma diferente consoante as suas propriedades físicas: algumas aderem mais ao estacionário e movem-se mais lentamente, separando-se das que se movem mais rapidamente(tempo de retenção diferente). O mesmo se aplica ao símile da corrida: à medida que os corredores avançam na pista, vão sendo separados de acordo com a sua condição física.

Como funciona a cromatografia

  1. Preparação da amostra: Toda a cromatografia começa com uma mistura, que será a fase móvel. Esta é composta por um fluido solvente (que pode ser líquido ou gasoso) e, no caso da marijuana, a mistura será composta pelas flores de cannabis, o Óleo CBDPodemos identificar e quantificar os canabinóides, que neste caso são chamados canabinóides, e podemos também identificar e quantificar os canabinóides que estão presentes nos canabinóides. analitos. Estes analitos são os componentes a analisar, os compostos que são separados e medidos durante a cromatografia. (A mesma técnica é utilizada para identificar terpenos, flavonóides e outros compostos, mas esta é uma história para outro artigo).
  2. Injeção: A amostra é circulada sob pressão através de uma coluna composta por um material sólido ou semi-sólido(fase estacionária).
  3. Separação: Cada um dos componentes da amostra difere em termos de caudal, tamanho e polaridade, levando à separação à medida que fluem através da coluna (alguns aderem mais do que outros).
  4. Deteção: À medida que os componentes separados deixam a coluna, passam por um detetor que regista a quantidade de cada um que sai. Isto é normalmente efectuado medindo a quantidade de luz ultravioleta que cada componente absorve.
  5. Análise dos dados: Os componentes separados são detectados e registados num computador, que gera um gráfico denominado cromatograma, cuja interpretação permite a identificação e a quantificação precisas dos diferentes canabinóides presentes.
Cromatografia em fase gasosa, esquema
Cromatografia em fase gasosa, esquema

Cromatografia em fase gasosa: Análise de canabinóides na sua forma neutra

A cromatografia gasosa (CG) utiliza o gás como fase móvel e a separação ocorre numa coluna, que pode ser um tubo capilar. Nesta técnica, é necessário utilizar aquecedores para obter uma amostra uniforme ao longo da coluna capilar.

A cromatografia gasosa só pode medir os canabinóides na sua forma neutra.

Dado que a amostra tem de ser aquecida, a CG induz a descarboxilação dos canabinóides para a sua forma ácida. Por conseguinte, ao avaliar os canabinóides através desta técnica, apenas podem ser avaliados os canabinóides neutros, uma vez que o calor descarboxila as formas ácidas. Esta pode ser uma das desvantagens da cromatografia gasosa.

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC): Medição de canabinóides em forma ácida e neutra

A cromatografia líquida utiliza uma fase móvel líquida, podendo também ser utilizada uma coluna. Na indústria da canábis, uma das técnicas mais utilizadas é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), em que partículas muito pequenas são embaladas a alta pressão.

Ao contrário da cromatografia gasosa, a cromatografia líquida não requer o aquecimento da mistura e pode, por conseguinte, ser utilizada para medir a concentração de diferentes canabinóides, como o CBD e o THC, mesmo na sua forma ácida. Isto torna-o o método de teste de eleição para produtos de canábis.

Na HPLC, são utilizadas bombas para fazer passar este líquido pressurizado (solvente) que contém a mistura a analisar através da coluna de HPLC. Cada um dos componentes da amostra difere no seu caudal, levando à separação à medida que flui através da coluna.

Interpretação dos resultados da análise por HPLC de canabinóides

A figura abaixo mostra o resultado de uma análise de canabinóides utilizando HPLC [1]. Este tipo de gráfico, chamado cromatogramamostra o tempo no eixo X e a intensidade do sinal do detetor no eixo Y. Cada pico no gráfico representa um componente diferente da amostra, e a área sob o pico pode ser utilizada para determinar a quantidade desse componente na amostra.

O eixo X (eixo horizontal) mostra o tempo de separação para cada um dos analitos, pelo que a unidade é minutos. Como se pode ver, cada um dos analitos, que neste caso são canabinóides, difere no tempo (o número de minutos) que leva a passar pela fase líquida.

O eixo Y (eixo vertical) representa a intensidade do sinal, uma medida de absorvância cuja unidade é aUnidade de Absorvância ( UA) e quantifica a quantidade do analito. Esta medição baseia-se na quantidade de absorção de luz, ou seja, a quantidade de luz absorvida por cada um dos analitos. Quanto maior for o pico no eixo y, maior será a intensidade e, por conseguinte, maior será a quantidade desse analito presente na amostra e maior será a sua área sob a curva. Na figura abaixo, a unidade no eixo Y é mAU (milli-Absorbance Units), que é um milésimo da Unidade de Absorvância.

Cada um dos canabinóides tem um tempo de retenção particular, o que nos permite diferenciá-los numa cromatografia. Quanto maior for o pico, maior é a concentração deste canabinóide na amostra..

Depois, o resultado da cromatografia indica-nos, num determinado tempo (eixo X), se uma substância a analisar está (ou não) presente numa determinada intensidade (eixo X). Y). No nosso caso, cada um dos canabinóides tem um tempo de retenção específico, e quanto mais deste canabinóide específico na amostra, maior o valor no eixo Y.

Por conseguinte, a fim de diferenciar cada um dos canabinóides no cromatograma, é necessário dispor de um padrão para conhecer o tempo de retenção específico de cada um dos analitos (canabinóides). O eixo Y é uma medida de fluorescência única para cada um dos canabinóides, razão pela qual é necessário um padrão, como guia, para saber qual o canabinóide que cai nesse pico específico.

Exemplo de um cromatograma de uma amostra de canábis. Análise de canabinóides
Exemplo de um cromatograma de uma amostra de canábis. Resultado de uma análise de canabinóides por HPLC. Figura retirada do artigo de Gul et al [1] que mostra os canabinóides numa amostra. Cada um dos analitos, que neste caso são canabinóides, difere no seu tempo de retenção. É por esta razão que no eixo X, que mostra o tempo e é medido em minutos, os canabinóides aparecem em locais diferentes. O eixo Y, que mostra a absorvância (unidades de absorvância em miligrama), indica a intensidade e, por conseguinte, a quantidade dos analitos individuais.

Demorei algum tempo a perceber o que representam os dois primeiros picos da figura acima e tive de consultar colegas especialistas na matéria, que me explicaram que o primeiro pico, que não é referido na figura, é produzido pela injeção da fase líquida e corresponde às moléculas que não interagem na coluna, sendo designado por frente de solvente (frente solvente).

O tempo inicial antes do pico da frente de solvente é o tempo necessário para que esta fase móvel passe através da coluna e é designado porvolume morto.

O segundo pico, denominado “I.S” na figura, é o pico dopadrão interno ( IS), que no caso do artigo utilizou a 4-androsteno-3,17-diona (4-androsteno-3,17-diona). O pico deste composto químico no cromatograma serve de referência para calcular a quantidade de canabinóides presentes na amostra.

Espectrometria de massa (MS): Determinação do peso molecular dos canabinóides

A espetrometria de massa (MS) separa partículas, tais como átomos e moléculas, diferenciando os seus rácios carga-massa. Esta técnica é utilizada para determinar o peso das partículas e é uma ferramenta analítica que mede a relação entre a massa e a carga(m/z) de uma ou mais moléculas presentes na amostra.

Estas medições podem ser utilizadas para calcular o peso molecular exato dos componentes da amostra. A espetrometria de massa pode identificar compostos desconhecidos através da determinação do seu peso molecular, sendo também utilizada para quantificar compostos conhecidos e determinar a estrutura dos compostos e moléculas presentes.

A técnica combinada GC-MS: Melhorar a exatidão na determinação de canabinóides

Uma das técnicas mais utilizadas para a determinação de canabinóides é a combinação da cromatografia gasosa com a espetrometria de massa (GC-MS).

Combina então a capacidade da cromatografia gasosa para separar os componentes de uma amostra e a capacidade da espetrometria de massa para identificar e quantificar os componentes individuais. O resultado é muito sensível e preciso na medição da quantidade e do tipo de canabinóides presentes na amostra.

Em conclusão…

Bem, eis algumas informações básicas sobre as diferentes técnicas atualmente utilizadas para medir canabinóides na indústria da canábis. Se houver algum leitor de química por aí, gostaria de saber o que pensam sobre esta informação de química elementar.

Referencias
  1. Gul, W., et al., Determinação de 11 canabinóides em biomassa e extractos de diferentes variedades de Cannabis utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Jornal da AOAC International, 2015. 98(6): p. 1523-1528.

Dra. Daniela Vergara
Investigadora y catedrática | Especialista en cultivos emergentes y consultora de cannabis

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