Come viene eseguita l’analisi dei cannabinoidi?

Analisi dei cannabinoidi

Vi siete mai chiesti come vengono determinati i livelli di CBD, THC e altri cannabinoidi nella marijuana o negli oli di CBD? In questo post spiegheremo la scienza alla base dei metodi che consentono di quantificare i cannabinoidi, come la gascromatografia, l’HPLC e la spettrometria di massa, e come queste tecniche vengono utilizzate insieme per analizzare i componenti della cannabis.

Introduzione all’analisi dei cannabinoidi

L’analisi dei cannabinoidi viene utilizzata per diversi scopi, sia terapeutici che normativi. Il suo scopo principale è quello di determinare la potenza e la qualità dei prodotti a base di cannabis, ma può anche essere utilizzato per classificare legalmente un campione come “canapa” o “marijuana” in base al suo contenuto di THC. Si tratta quindi di uno strumento molto utile sia per i consumatori che per i professionisti dell’industria della cannabis.

Cosa sono i cannabinoidi e come vengono prodotti nella pianta?

I cannabinoidi sono una classe di composti chimici che si trovano prevalentemente nella pianta di Cannabis sativa . Questi si formano nei tricomi, strutture ghiandolari molto piccole che si trovano soprattutto nei fiori di cannabis delle piante femmine, meglio conosciute come le cime di marijuana .

Una particolarità dei cannabinoidi è che sono prodotti dalla pianta nella loro forma acida, espressa con una “A” alla fine dell’acronimo. Ecco perché alcuni dei composti acidi più noti sono l’acido Δ-9-tetraidrocannabinolo (THCA) e l’acido cannabidiolico (CBDA).

Quando i cannabinoidi vengono riscaldati, si trasformano nelle forme neutre, i cannabinoidi che tutti conosciamo o quelli più popolari, come ad esempio tetraidrocannabinolo (THC) y cannabidiolo ( CBD ). Ciò si verifica con il riscaldamento, in quanto l’anidride carbonica(CO2) viene persa, in un processo chiamato decarbossilazione .

Queste forme acide e neutre di cannabinoidi possono essere misurate in diversi modi e in questo articolo ne illustrerò alcuni.

Comprendere la cromatografia: uno strumento chiave nell’analisi dei cannabinoidi

Che cos’è la cromatografia?

Uno dei metodi più comuni per misurare i cannabinoidi nelle loro forme acide e neutre è la cromatografia. La cromatografia è una tecnica di separazione, eseguita in laboratorio con apparecchiature specializzate, in cui gli analiti o i composti chimici presenti in un campione vengono isolati al fine di identificarli.

Per capire meglio, possiamo immaginare la cromatografia come una gara. La“traccia” è la fase stazionaria, che non si muove e attraverso la quale passa la miscela che vogliamo analizzare. I“corridori” sono la fase mobile, che si muove lungo la traccia o fase stazionaria. Le sostanze cannabinoidi, come i corridori, si muovono in modo diverso a seconda delle loro proprietà fisiche: alcune aderiscono maggiormente allo stazionario e si muovono più lentamente, separandosi da quelle che si muovono più velocemente(diverso tempo di ritenzione). Lo stesso varrebbe per la similitudine della corsa: man mano che i corridori avanzano lungo la pista, saranno separati in base alla loro condizione fisica.

Come funziona la cromatografia

  1. Preparazione del campione: tutte le cromatografie iniziano con una miscela, che sarà la fase mobile. Questa è composta da un fluido solvente (che può essere liquido o gassoso) e, nel caso della marijuana, la miscela sarà composta dai fiori di cannabis, il Olio di CBDPossiamo identificare e quantificare i cannabinoidi, che in questo caso sono chiamati cannabinoidi, e possiamo anche identificare e quantificare i cannabinoidi presenti nei cannabinoidi. analiti. Questi analiti sono i componenti da analizzare, i composti che vengono separati e misurati durante la cromatografia. (La stessa tecnica viene utilizzata per identificare terpeni, flavonoidi e altri composti, ma questa è una storia per un altro articolo).
  2. Iniezione: Il campione viene fatto circolare sotto pressione attraverso una colonna costituita da un materiale solido o semisolido(fase stazionaria).
  3. Separazione: ciascuno dei componenti del campione differisce per portata, dimensioni e polarità, determinando una separazione durante il passaggio attraverso la colonna (alcuni aderiscono più di altri).
  4. Rilevazione: quando i componenti separati lasciano la colonna, passano attraverso un rilevatore che registra la quantità di ciascuno di essi. Di solito si misura la quantità di luce ultravioletta assorbita da ciascun componente.
  5. Analisi dei dati: I componenti separati vengono rilevati e registrati su un computer, che genera un grafico chiamato cromatogramma, la cui interpretazione permette di identificare e quantificare con precisione i diversi cannabinoidi presenti.
Gascromatografia, schematica
Gascromatografia, schematica

Gascromatografia: Analisi dei cannabinoidi nella loro forma neutra

La gascromatografia (GC ) utilizza il gas come fase mobile e la separazione avviene in una colonna, che può essere un tubo capillare. In questa tecnica è necessario utilizzare dei riscaldatori per avere un campione uniforme lungo la colonna capillare.

La gascromatografia può misurare i cannabinoidi solo nella loro forma neutra.

Poiché il campione deve essere riscaldato, la GC induce la decarbossilazione dei cannabinoidi nella loro forma acida. Pertanto, quando si valutano i cannabinoidi con questa tecnica, è possibile valutare solo i cannabinoidi neutri, poiché il calore decarbossila le forme acide. Questo può essere uno degli svantaggi della gascromatografia.

Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC): misurazione dei cannabinoidi in forma acida e neutra

La cromatografia liquida utilizza una fase mobile liquida, dove può essere utilizzata anche una colonna. Nell’industria della cannabis, una delle tecniche più utilizzate è la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), in cui particelle molto piccole vengono impacchettate ad alta pressione.

A differenza della gascromatografia, la cromatografia liquida non richiede il riscaldamento della miscela e può quindi essere utilizzata per misurare la concentrazione di diversi cannabinoidi, come CBD e THC, anche nella loro forma acida. Questo lo rende il metodo di analisi preferito per i prodotti a base di cannabis.

Nell’HPLC, le pompe vengono utilizzate per far passare questo liquido pressurizzato (solvente) contenente la miscela da analizzare attraverso la colonna HPLC. Ciascuno dei componenti del campione differisce nella sua velocità di flusso, portando alla separazione durante il passaggio attraverso la colonna.

Interpretazione dei risultati dell’analisi HPLC dei cannabinoidi

La figura seguente mostra il risultato di un’analisi dei cannabinoidi mediante HPLC [1]. Questo tipo di grafico, chiamato cromatogrammamostra il tempo sull’asse delle ascisse e l’intensità del segnale del rivelatore sull’asse delle ordinate. Ogni picco sul grafico rappresenta un diverso componente del campione e l’area sotto il picco può essere utilizzata per determinare la quantità di quel componente nel campione.

L’asse X (asse orizzontale) mostra il tempo di separazione per ciascuno degli analiti, quindi l’unità di misura sono i minuti. Come si può notare, ciascuno degli analiti, che in questo caso sono cannabinoidi, differisce per il tempo (il numero di minuti) che impiega a passare attraverso la fase liquida.

L’asse Y (asse verticale) rappresenta l’intensità del segnale, una misura di assorbanza la cui unità di misura è l’unità di assorbanza ( AU) e quantifica la quantità di analita. Questa misurazione si basa sulla quantità di assorbimento della luce, cioè su quanta luce viene assorbita da ciascuno degli analiti. Quanto più alto è il picco sull’asse delle ordinate, tanto più alta è l’intensità e quindi maggiore è la quantità di analita presente nel campione e maggiore è l’area sotto la curva. Nella figura sottostante l’unità sull’asse Y è mAU (milli-Absorbance Units), ovvero un millesimo dell’unità di assorbanza.

Ciascuno dei cannabinoidi ha un particolare tempo di ritenzione, che ci permette di differenziarli in una cromatografia. Più alto è il picco, più alta è la concentrazione di questo cannabinoide nel campione..

Poi, il risultato della cromatografia ci dice, in un determinato tempo (asse X), se un analita è (o non è) presente a una particolare intensità (asse X). Y). Nel nostro caso, ciascuno dei cannabinoidi ha un particolare tempo di ritenzione, e maggiore è la quantità di questo particolare cannabinoide nel campione, più alto è il valore sull’asse Y.

Pertanto, per differenziare ciascuno dei cannabinoidi nel cromatogramma, è necessario disporre di uno standard per conoscere il tempo di ritenzione specifico di ciascuno degli analiti (cannabinoidi). L’asse Y è una misura di fluorescenza unica per ciascuno dei cannabinoidi, motivo per cui è necessario uno standard, come guida, per sapere quale cannabinoide cade su quel particolare picco.

Esempio di cromatogramma di un campione di cannabis. Analisi dei cannabinoidi
Esempio di cromatogramma di un campione di cannabis. Risultato dell’analisi dei cannabinoidi mediante HPLC. Figura tratta dall’articolo di Gul et al [1] che mostra i cannabinoidi in un campione. Ciascuno degli analiti, che in questo caso sono cannabinoidi, differisce per il suo tempo di ritenzione. È per questo motivo che sull’asse X, che mostra il tempo ed è misurato in minuti, i cannabinoidi appaiono in posizioni diverse. L’asse Y che mostra l’assorbanza (milli-Absorbance Units) indica l’intensità e quindi la quantità dei singoli analiti.

Mi ci è voluto un po’ di tempo per capire cosa rappresentassero i primi due picchi nella figura qui sopra e ho dovuto informarmi presso colleghi esperti del settore, che mi hanno spiegato che il primo picco, che non è nominato nella figura, è prodotto dall’iniezione della fase liquida e rappresenta le molecole non interagenti nella colonna, è chiamato fronte del solvente (fronte solvente).

Il tempo iniziale prima del picco del fronte del solvente è il tempo necessario a questa fase mobile per passare attraverso la colonna ed è chiamatovolume morto.

Il secondo picco, chiamato “I.S” nella figura, è il picco dellostandard interno ( IS), che nel caso dell’articolo ha utilizzato il 4-androstene-3,17-dione (4-androstene-3,17-dione). Il picco di questo composto chimico nel cromatogramma serve come riferimento per calcolare la quantità di cannabinoidi presenti nel campione.

Spettrometria di massa (MS): determinazione del peso molecolare dei cannabinoidi

La spettrometria di massa (MS) separa particelle come atomi e molecole differenziando i loro rapporti carica/massa. Questa tecnica viene utilizzata per determinare il peso delle particelle ed è uno strumento analitico che misura il rapporto tra la massa e la carica(m/z) di una o più molecole presenti nel campione.

Queste misure possono essere utilizzate per calcolare il peso molecolare esatto dei componenti del campione. La spettrometria di massa è in grado di identificare i composti sconosciuti determinandone il peso molecolare e viene utilizzata anche per quantificare i composti noti e determinare la struttura dei composti e delle molecole presenti.

La tecnica combinata GC-MS: migliorare l’accuratezza nella determinazione dei cannabinoidi

Una delle tecniche più utilizzate per la determinazione dei cannabinoidi è la combinazione di gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS).

Combina quindi la capacità della gascromatografia di separare i componenti di un campione e la capacità della spettrometria di massa di identificare e quantificare i singoli componenti. Il risultato è molto sensibile e preciso nel misurare la quantità e il tipo di cannabinoidi presenti nel campione.

In conclusione…

Ecco alcune informazioni di base sulle diverse tecniche attualmente utilizzate per misurare i cannabinoidi nell’industria della cannabis. Se c’è qualche lettore di chimica là fuori, mi piacerebbe sapere cosa ne pensate di queste informazioni di chimica elementare.

Referencias
  1. Gul, W., et al., Determinazione di 11 cannabinoidi nella biomassa e negli estratti di diverse varietà di Cannabis mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. Journal of AOAC International, 2015. 98(6): p. 1523-1528.

Dra. Daniela Vergara
Investigadora y catedrática | Especialista en cultivos emergentes y consultora de cannabis

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