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¿Cómo se realiza un análisis de cannabinoides?

Cromatografia de gases

¿Alguna vez se han preguntado cómo se determinan los niveles de CBD, THC y otros cannabinoides en la marihuana o en los aceites de CBD? En este post vamos a explicar la ciencia detrás de los métodos que permiten cuantificar los cannabinoides, como la cromatografía de gases, HPLC y la espectrometría de masas, y cómo estas técnicas se utilizan conjuntamente para analizar los componentes del cannabis.

Introducción al análisis de cannabinoides 

El análisis de cannabinoides se utiliza con diversos fines, tanto terapéuticos como regulatorios. Su finalidad principal es determinar la potencia y calidad de los productos de cannabis, pero también se puede utilizar para clasificar legalmente una muestra como “cáñamo” o “marihuana”, basándose en su contenido en THC. Constituye así una herramienta muy útil tanto para consumidores como para profesionales de la industria del cannabis.

¿Qué son los cannabinoides y cómo se producen en la planta?

Los cannabinoides son un tipo de compuestos químicos que se encuentran predominantemente en la planta de Cannabis sativa. Estos se forman en los tricomas, unas estructuras glandulares muy pequeñas que se encuentran sobre todo en las flores de cannabis de las plantas hembra, más conocidos como los cogollos de marihuana.

Una particularidad de los cannabinoides es que son producidos por la planta en su forma ácida, expresado con una “A” al final de las siglas. Es por esto que unos de los más conocidos compuestos ácidos son el ácido Δ-9-tetrahydrocannabinol (THCA) y el ácido cannabidiólico (CBDA). 

Cuando los cannabinoides se calientan, éstos pasan a las formas neutras, los cannabinoides que todos conocemos o más populares, como el tetrahidrocannabinol (THC) y cannabidiol (CBD). Esto ocurre con el calentamiento, al perder dióxido de carbono (CO2), en un proceso que se llama descarboxilación

Estas formas ácidas y neutras de los cannabinoides se pueden medir de diferentes maneras, y en este escrito les explicaré algunas. 

Comprendiendo la cromatografía: Una herramienta clave en el análisis de cannabinoides

¿Qué es la cromatografía? 

Una de las formas más comunes de medir los cannabinoides en sus formas ácidas y neutras es la cromatografía. La cromatografía es una técnica de separación, realizada en laboratorios con equipos especializados, donde se aíslan los analitos o compuestos químicos que componen una muestra, con el fin de identificarlos. 

Para entenderlo mejor, podemos imaginarnos la cromatografía como una carrera. La “pista” es la fase estacionaria, que no se mueve y por donde pasa la mezcla que queremos analizar. Los “corredores” son la fase móvil, que se desplaza por la pista o fase estacionaria. Las sustancias cannabinoides, como los corredores, se mueven de manera diferente según sus propiedades físicas: algunas se adhieren más a la estacionaria y se mueven más lentamente, separándose de las que se mueven más rápido (distinto tiempo de retención). Lo mismo ocurriría con el símil de la carrera: a medida que los corredores avancen por la pista, se irán separando según su condición física

Cómo funciona la cromatografía

  1. Preparación de la muestra: Toda cromatografía comienza con una mezcla, que será la fase móvil. Ésta se compone de un fluido solvente (que puede ser líquido o gaseoso) y, en el caso de la marihuana, la mezcla estará compuesta por las flores de cannabis, el aceite de CBD, las golosinas, o cualquier otro producto que consumimos y del cual queremos identificar y cuantificar los cannabinoides, que en este caso se llaman analitos. Estos analitos son los componentes que se van a analizar, aquellos compuestos que se separan y miden durante la cromatografía. (La misma técnica se utiliza para identificar terpenos, flavonoides y otros compuestos, pero esto es historia para otro escrito).
  2. Inyección: La muestra se hace circular a presión por una columna compuesta por un material sólido o semisólido (fase estacionaria). 
  3. Separación: Cada uno de los componentes de la muestra difiere en su tasa de flujo, tamaño y polaridad, lo que lleva a separarlos cuando fluyen a través de la columna (unos se adhieren más que otros). 
  4. Detección: A medida que los componentes separados salen de la columna, pasan por un detector que registra la cantidad de cada uno que sale. Esto se hace generalmente midiendo la cantidad de luz ultravioleta que cada componente absorbe. 
  5. Análisis de datos: Los componentes separados se detectan y registran en un ordenador, que genera un gráfico llamado cromatograma, la interpretación del cual permite la identificación y cuantificación precisa de los distintos cannabinoides presentes.
Cromatografía de gases, esquema
Cromatografía de gases, esquema

Cromatografía de gases: Análisis de cannabinoides en su forma neutra

La cromatografía de gases (GC, por las siglas en inglés de Gas Chromatography) usa gas como fase móvil y la separación ocurre en una columna, que puede ser un tubo capilar. En esta técnica es necesario usar calentadores para tener una muestra uniforme a lo largo de la columna capilar. 

La cromatografía de gases sólo puede medir cannabinoides en su forma neutra

Al ser necesario calentar la muestra, la GC induce a la descarboxilación de los cannabinoides en su forma ácida. Por lo tanto, cuando se evalúan los cannabinoides bajo esta técnica, sólo se puede hacer con los cannabinoides neutros, ya que el calor descarboxila las formas ácidas. Esto puede ser una de las desventajas de la cromatografía de gases.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC): Medición de cannabinoides en forma ácida y neutra

La cromatografía líquida usa una fase móvil líquida, dónde también se puede usar una columna. En la industria del cannabis, una de las técnicas más usadas es la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC por High Performance Liquid Chromatography, en inglés), dónde se empacan partículas muy pequeñas a una presión alta. 

A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía líquida no requiere del calentamiento de la mezcla y por lo tanto puede ser usada para medir la concentración de diferentes cannabinoides, como el CBD y el THC, incluso en su forma ácida. Esto lo convierte en el método de análisis de preferencia para los productos de cannabis.

En la HPLC se utilizan bombas para pasar este líquido presurizado (solvente) que contiene la mezcla a analizar por la columna de HPLC. Cada uno de los componentes de la muestra difiere en su tasa de flujo, lo que lleva a separarlos cuando fluyen a través de la columna.

Interpretación de los resultados de análisis de cannabinoides en HPLC

La siguiente figura muestra el resultado de un análisis de cannabinoides usando HPLC [1]. Este tipo de gráfico, llamado cromatograma, muestra el tiempo en el eje X y la intensidad de la señal del detector en el eje Y. Cada pico en el gráfico representa un componente distinto de la muestra, y el área bajo el pico puede usarse para determinar la cantidad de ese componente en la muestra.

El eje X (eje horizontal) muestra el tiempo de separación de cada uno de los analitos, por lo tanto, la unidad son los minutos. Como pueden observar, cada uno de los analitos, que en este caso son cannabinoides, difiere en el tiempo (el número de minutos) que se demoran en pasar por la fase líquida. 

El eje Y (eje vertical) representa la intensidad de la señal, una medida de absorbancia cuya unidad es el AU (Absorbance Unit, en inglés) y cuantifica la cantidad del analito. Esta medida tiene como origen la cantidad de absorción de luz, es decir, cuánta luz absorbe cada uno de los analitos. Entre mayor sea el pico en el eje Y, mayor la intensidad, y por lo tanto más de ese analito está presente en la muestra y su área bajo la curva es mayor. En la figura a continuación la unidad en el eje Y es mAU (milli-Absorbance Units), que es una milésima parte del Absorbance Unit. 

Cada uno de los cannabinoides tiene un tiempo de retención en particular, lo que nos permite diferenciarlos en una cromatografía. Cuanto más alto sea el pico, mayor concentración de este cannabinoide se encuentra en la muestra

Entonces, el resultado de la cromatografía nos dice, en un tiempo determinado (eje X), si un analito está (o no) presente a una intensidad en particular (eje Y). En nuestro caso, cada uno de los cannabinoides tiene un tiempo de retención en particular, y, entre más de este cannabinoide en particular haya en la muestra, mayor es el valor en el eje Y. 

Es por esto que, para poder diferenciar cada uno de los cannabinoides en el cromatograma, se necesita tener un estándar para saber el tiempo específico de retención para cada uno de los analitos (cannabinoides). El eje Y es una medida de fluorescencia única para cada uno de los cannabinoides es por esta razón que se necesita in standard, como una guía, para saber qué cannabinoide cae en ese pico en particular.

Ejemplo de cromatograma de una muestra de cannabis. Analisis de cannabinoides
Ejemplo de cromatograma de una muestra de cannabis. Resultado de un análisis de cannabinoides usando HPLC. Figura tomada del artículo de Gul y colaboradores [1] dónde se expone los cannabinoides de una muestra. Cada uno de los analitos, que en este caso son cannabinoides, difiere en su tiempo de retención. Es por esta razón, que en el eje X que muestra el tiempo y se mide en minutos, los cannabinoides aparecen en diferentes ubicaciones. El eje Y que muestra la absorbancia (milli-Absorbance Units) muestra la intensidad y por lo tanto la cantidad de cada uno de los analitos.

Me tomó bastante tiempo averiguar qué representan los dos primeros picos de la figura anterior y tuve que indagar con colegas expertos en el área, que me explicaron que el primer pico, que no tiene nombre en la figura, es producido por la inyección de la fase líquida y son las moléculas que no interactúan en la columna, se llama el frente del disolvente (solvent front, en inglés). 

El tiempo inicial antes del pico del frente del disolvente es el tiempo que necesita esta fase móvil para atravesar la columna y se llama el volumen muerto (dead volume, en inglés). 

El segundo pico que en la figura llama “I.S”, es el del estándar (internal standard, IS, en inglés) que en el caso del artículo usaron el 4-androsteno-3,17-diona (4-androstene-3,17-dione). El pico de este compuesto químico en el cromatograma sirve como referencia para calcular la cantidad de cannabinoides presentes en la muestra.

Espectrometría de masas (MS): Determinación del peso molecular de los cannabinoides

La espectrometría de masas (MS, por las siglas inglesas) separa partículas como átomos y moléculas diferenciando las tasas de su carga con respecto a la masa. Esta técnica se usa para determinar el peso de las partículas y es una herramienta analítica que mide la tasa entre la masa y la carga (m/z) de una o más moléculas presentes en la muestra. 

Estas medidas se pueden usar para calcular el peso molecular exacto de los componentes de la muestra. La espectrometría de masas puede identificar compuestos desconocidos determinando su peso molecular, y también se usa para cuantificar compuestos conocidos y determinar la estructura de los componentes y moléculas presentes. 

La técnica combinada GC-MS: Mejorando la precisión en la determinación de cannabinoides

Una de las técnicas más usadas actualmente para la determinación de cannabinoides es la combinación de la cromatografía de gas con la espectrometría de masas (GC-MS, por sus siglas en inglés). 

Entonces, se combina la capacidad de la cromatografía de gases para separar los componentes de una muestra y la capacidad de la espectrometría de masas para identificar y cuantificar los componentes individuales. El resultado es muy sensible y preciso en cuanto a la medición de la cantidad y el tipo de cannabinoides presentes en la muestra.

En conclusión…

Bueno, aquí les dejo la información básica sobre las diferentes técnicas que se usan actualmente para medir cannabinoides en la industria del cannabis. Si hay algún químico lector, me encantaría saber qué opinan sobre esta información de química elemental.

Referencias
  1. Gul, W., et al., Determination of 11 cannabinoids in biomass and extracts of different varieties of Cannabis using high-performance liquid chromatography. Journal of AOAC International, 2015. 98(6): p. 1523-1528.